By Dr David Watling, R&D Director, BIOQUELL UK Ltd
SubscribeEin biologischer Indikator (BI) wird in der fünften Ausgabe von Block "Desinfektion, Sterilisierung und Präservation" wie folgt definiert:-.
"Biologische Indikatoren (BI): Eine standardisierte Zubereitung von bakteriellen Sporen auf oder in einem Träger, der zur Demonstration, ob sterile Bedingungen erfüllt worden sind oder nicht, benutzt wird. Sporen von anderen Organismen werden für andere Sterilisiermethoden benutzt."
Das Schlüsselwort in dieser Definition ist "standardisiert". BIs wurden und werden benutzt, um sporidische Begasungszyklen zu validieren und es ist nicht ungewöhnlich, dass ein sporidischer Begasungszyklus, der mit "standardisierten" biologischen Indikatoren validiert worden ist, nicht gelingt, wenn er später neu validiert wird.
Das Versagen des Neuvalidierungszyklus wurde durch ein Versagen des sporidischen Begasungsvorgangs, einer Änderung des begasten Systems, einer Veränderung in der Umwelt oder den biologischen Indikatoren verursacht.
Der parenterale Drogenverband (PDA) hat einen Stab zusammengestellt, um einen Monograph über die "Empfehlungen für die Spezifikation, Herstellung, Kontrolle und Gebrauch von biologischen Indikatoren" vorzubereiten, um Benutzern von BIs bei der Auswahl, Anwendung und den Qualitätskontrollmassnahmen, die notwendig sind, um die Zuverlässigkeit der BIs zu erhöhen, zu unterstützen. Gegenwärtig is das BI jedoch der variablste Faktor in jedem sporidischen Begasungsvorgang.
Zum Zweck dieses Beitrags werde ich mich darauf beschränken, die biologischen Indikatoren, die allgemein für die Validierung der sporidischen Begasung mit Wasserstoffperoxyd zu diskutieren.
Zusammensetzung eines Biologischen Indikators
Das Trägermaterial ist meist rostfreier Stahl, obwohl darauf hingewiesen werden muss, dass das Material, aus dem der Träger hergestellt ist, seine Form und Flächenlackierung eine Auswirkung auf die Leistung des fertigen BI hat.
Der ausgewählte Mikroorganismus sollte einen hohen Widerstand gegen Wasserstoffperoxyddampf und einen höheren Widerstand gegen den sporidischen Begasungszyklus als die natürlich auftretenden Mikroorganismen haben.
Der am meisten benutzte Organismus für BIs zur sporidischen Begasung mit Wasserstoffperoxyd sind Sporen des Geobacillus stearothermophilus . Sie haben einen nachgewiesenen Widerstand gegen Wasserstoffperoxyddampf, sind nicht pathogenisch und inkubieren bei 55 bis 60°C und reduzieren daher das Mischverseuchungsrisiko.
Der primäre Pack soll den inokulierten Coupon vor Beschädigung schützen und das Austreten der Sporen verhindern. Es sollte auch für den Wasserstoffperoxyddampf durchlässig sein, damit der Dampf die Sporen erreicht, die auf den Träger inokuliert worden sind.
Dezimale Reduzierung oder D-Wert
Bevor die Zusammensetzung und Leistung der BIs näher besprochen wird, ist es notwendig, den D-Wert zu definieren. Die Dezimale Reduktion oder D-Wert ist die Zeit, die es dauert, die lebensfähige Population der Mikroorganismen um einen Faktor 10 zu reduzieren, wenn er einem konstanten Stress ausgesetzt wird. Daher: wenn der D-Wert 2 Minuten ist und die anfängliche lebensfähige Population 1 000 000 ist, dann wird die lebensfähige Population nach 2 Minuten auf 100 000 und so weiter reduziert.
Daraus folgt, dass nach 10 Minuten die lebensfähige Population 10 ist. Das D-Wert Konzept is zur Leistunsvorhersage eines BI hilfreich und stellt Vergleiche zwischen einer BI-Quelle mit einer anderen an. Die andere Qualitätskontrollmassnahme, die später besprochen wird, ist die Anzahl der Sporen auf dem Träger.
Das Trägermaterial
Mehrere Studien wurden schon veröffentlicht, um festzustellen, ob die Leistung des BI vom Material des Substrats beeinflusst wird. Diese haben widersprüchliche Ergebnisse produziert. Eine Studie, die von Davenport unternommen und auf einer ISPE Barrier-Konferenz vorgetragen wurde, zeigte eine Variation in D-Werten von 1,1 für Hypalon bis zu 1,7 für rostfreien Stahl. Ähnliche Studien haben andere Ergebnisse, wahrscheinlich wegen der unterschiedlichen Dampfkonzentrationen.
Die Variation im D-Wert ist wahrscheinlich das Ergebnis einer Reaktion zwischen dem Substrat und dem Dampf, die die Zersetzung des Wasserstoffperoxyds verursacht, oder eine Änderung in den Mechanismen, die Kondensation verursachen. Es ist weit bekannt, dass sich die Kondensation auf einem Nukleus schneller als auf einem Staubpartikel bildet.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass sich die Kondensation vorzugsweise auf Mikroorganismen bildet, wenn sie auf glatten Flächen vorkommen. Dadurch wird die Kondensation in der unmittelbaren Umgebung verhindert. Wenn die Flächen um den Mikroorganismus herum rauh sind, dann kann sich die Kondensation ebenso auf der Fläche und nicht auf dem Mikroorganismus bilden. Dadurch wird die Zeit, die zur Abtötung notwendig ist, verlängert.
Zur Zeit verstehen wir die Mechanismen, die anscheinende Veränderungen im D-Wert auf unterschiedlichen Substraten verursachen, nicht. Es ist daher notwendig, die Qualität des Materials, das zur Herstellung des Trägers benutzt wird, und dessen Flächenlackierung sorgfältig zu kontrollieren.
des Materials, das zur Herstellung des Trägers benutzt wird, und dessen Flächenlackierung sorgfältig zu kontrollieren.
Mikroorganismus
In der Europäischen Pharmakopoee steht eine Empfehlung, dass Geobacillus stearothermophilus zur Validierung von sporidischen Zyklen mit Wasserstoffperoxyd benutzt werden sollte. Unter manchen Umständen kann erwartet werden, dass andere Mikroorganismen wahrscheinlich angetroffen werden, die einen höheren Widerstand gegen Wasserstoffperoxyddampf haben als G.
stearothermophilus Dann ist es notwendig, Studien durchzuführen, um den relativen Widerstand der verdächtigten Mikroorganismen im Vergleich zu G. stearothermophilus zu erstellen und dann eine informierte Entscheidung zu treffen, welcher der korrekte, zu benutzende Mikroorganismus ist.
Primärer Pack
Der primäre Pack ist dazu gedacht, den inokulierten Träger zu schützen und auch das Entweichen von Sporen zu verhindern. Es sollte aber nicht verhindern, dass der Dampf die Zielmikroorganismen erreicht. Es wurden mehrere Tests durchgeführt, um die Auswirkung des primären Packs auf den anscheinlichen D-Wert zu erstellen. Es wäre genauer, die Änderungen in den Stresswerten, die die Mikroorganismen erleben, anstelle der Änderung im D-Wert zu besprechen, da der D-Wert bei jedem Stresswert gleich sein sollte.
Was der primäre Pack bietet, ist eine Barriere, durch die der Dampf hindurch muss, um die Mikroorganismen zu erreichen. Wenn während des Vorgangs Kondensation erwartet wird, ist es wahrscheinlich, dass sich Kondensation auf dem primären Pack bildet, wodurch die ungehinderte Bewegung des Dampfs innerhalb des Packs verhindert und der Stresswert bedeutend reduziert wird.
Es ist interessant zu sehen, dass auch mit dieser Barriere der Kondensationsvorgang immer noch schneller ist als der Trockengasvorgang, wie es von der Zeit angezeigt wird, die es dauert, bis eine komplette Abtötung der BIs erzielt worden ist.
Temperaturauswirkungen
Als die Biodekontamination mit Wasserstoffperoxyddampf Anfang der 90iger Jahre eingeführt wurde, wurde es als Trockengasvorgang betrachtet. Im Gegensatz zu den Erwartungen war es jedoch schwieriger, eine Abtötung in Bereichen in Kammern mit höherer Temperatur zu erzielen. Es wurde anfangs angenommen, dass diese Anomalie auftritt, weil das Wasserstoffperoxyd sich schneller zersetzte als die Temperatur anstieg.
Tatsache war, dass ein Anstieg von nur wenigen Graden in der Oberflächentemperatur ein Poblem bereitete.. Dies ist gegensätzlich, weil chemische Reaktionen schneller vorgingen als die Temperatur anstieg und es daher erwartet wurde, dass bei höheren Temperaturen die Abtötungszeit reduziert wurde. Die Erklärung der erweiterten Abtötungszeit zu höheren Temperaturen ist, dass sich der Vorgang darauf verlässt, dass die Kondensation wirksam ist und die Bereiche in der Kammer mit höheren Temperaturen die letzten sind, die Kondensation anziehen.
Es wird daraus gefolgert, dass, wenn BIs zur Vorgangskontrolle benutzt werden, diese eine Temperatur haben sollten, die den Flächen, die sie darstellt, ähnlich ist. Ein Anstieg der Temperatur des BI im Vergleich zu seiner Umgebung verlängert die Zeit, die notwendig ist, eine Abtötung zu erzielen.
Die meisten BIs werden hergestellt, indem Sporen auf kleine Schälchen aus rostfreiem Stahl inokuliert werden. Das BI wird dann in der Kammer, die biodekontamination werden soll, suspendiert und hat keinen thermischen Kontakt mit der Umgebung, die es darstellen soll. Der Begasungsvorgang fügt der Kammer Hitze zu, wenn die Dämpfe zu einer erhöhten Temperatur eingeführt werden.
Teile, in der Kammer, die eine niedrige thermische Masse haben und keinen thermischen Kontakt mit den umliegenden Flächen haben, heizen sich schneller auf als die Umgebung. Die BIs sind ein typisches Beispiel einer niedrigen thermischen Masse, die nicht in Kontakt steht und daher verlängerte Abtötungszeiten über den Flächen, die sie vertreten sollen, angeben.
Normale handelsübliche BIs
Handelsübliche BIs sind von mehreren Quellen erhältlich. Jede BI-Gruppe sollte mit einem Testzertifikat versehen sein, was mindestens den D-Wert und die Bedingungen, unter denen sie vorgefunden wurden, die mittelwertige Population, das Ablaufdatum, die Chargennummer, den Organismus, die Lagerbedingungen und die empfohlenen Inkubationsbedingungen aufführen muss.
Diese Information kann jedoch die schlechte Qualität eines BI verstecken. Der PDA-Stab machte Photographien mit einem ablesenden Elektronmikroskop von mehreren handelsüblichen BIs, die alle eine angebliche Bevölkerung von ungefähr 106Geobacillus stearothermophilus Sporen auf rostfreien Stahlträgern hatten; vier davon sind in Abbildung 1 dargestellt und sind, wie gesehen, von sehr unterschiedlicher Qualität.
Die Photographie oben links. Die anderen drei Photographien zeigen alle hohe Debrismengen und Klumpen, in die der Dampf eindringen muss, bevor er die Sporen erreicht. Dies führt unvermeidlich zu Variationen in der Leistung des BI und Schwierigkeiten bei der Vorgangskontrolle und wird nicht im Testzertifikat des Herstellers angegeben.
Photographien des ablesenden Elektronmikroskops von 4 Biologischen Indikatoren - Mit freundlicher Genehmigung des PDA Stabs für Biologische Indikatoren.
Es ist nicht ungewöhnlich, D-Werte vorzufinden, die von 1,0 bis zu 2,0 Minuten von Charge zu Charge variieren, auch von Herstellern, die hochqalitative saubere Sporensuspensionen benutzen. Diese Variation im D-Wert würde anzeigen, dass eine Log 6 Reduzierung in entweder 6 oder 12 Minuten erzielt werden würde. Dies ist kein grosser Spielraum, wenn man einen Biodekontaminationszyklus betrachtet. Von einem anderen Standpunkt aus gesehen ist dies eine Variation von 100%, wenn es gegen den D-Wert von 1,0 Minute gegen die Stresswerte, die vom Hersteller verwendet werden, gemessen wird.
In der Praxis kann der Stresswert in einer echten Kammer viel niedriger sein und es wurde schon angezeigt, dass bei niedrigeren Stresswerten der prozentsatzige Unterschied in den D-Werten ansteigt. Daher kann ein 100%iger Anstieg zwischen Chargen zu einem Anstieg von 180% bei einem niedrigeren Stresswert sein.
Wenn BIs mit dem niedrigeren D-Wert von 1,0 Minute als Validierung eines Isolators mit einem Begasungszyklus von 30 Minuten verwendet und die Neuvalidierung wird mit einem BI, der einen D-Wert von 2,0 Minuten hat, unternommen. Es ist wahrscheinlich, dass der Vorgang versagt, da die Sicherheitsgrenze wahrscheinlich nicht ausreichend ist, um mit dem angestiegenen Widerstand des BI umzugehen.
Ein Test wurde mit drei verschiedenen BIs durchgeführt, wobei D-Werte vom Hersteller mit 1,2 (Charge 53), 1,4 (Charge 35) und 1,6 (Charge 24) Minuten gemeldet werden. Proben dieser drei Chargen werden mit Wasserstoffperoxyd in einem 110 m³ Raum mit maximaler Dampfkonzentration von 450 ppm und einer Anfangs-RH von über 45% begast.
Die BIs wurden in abgestimmten Intervallen in TSB gelegt und inkubiert. Die Zeit, die benötigt wurde, um eine vollständige Abtötung zu erzielen, wird in Abbildung 2 angezeigt. Obwohl der Unterschied im D-Wert zwischen Chargen 24 und 53 nur 0,4 Minuten oder 33% ist, ist der Unterschied bei der Abtötungszeit im Raum 100%.
Weil die Probenentnahmezeit im Raum relativ lang ist, ist es möglich, dass Charge 53 nach 6 Minuten und Charge 24 nach 16 Minuten abgetötet wurde. Es ist daher bestreitbar, dass der Unterschied in der Abtötungszeit zwischen diesen beiden Chargen 16 minus 10 Minuten, dh. 6 Minuten war, wobei ein Mindestunterschied in der Abtötungszeit von 60% im Vergleich zu einem Unterschied im D-Wert von 33% ist.
Es ist wahrscheinlich, dass sehr grosse Unterschiede im D-Wert, der vom Hersteller gemeldet wird und der erzielten Abtötungszeit im Raum das Ergebnis der Unterschiede bei den Testbedingungen sind. Der wichtigste davon ist die Dampfkonzentration; der D-Wert des Herstellers wurde bei ungefähr 1350 ppm erstellt im Vergleich zum Raumtest bei einer maximalen Konzentration von 450 ppm.
Stresswerte
Biologische Indikatoren werden mit den D-Werten und der Population verglichen. D-Werte sind aber nur bei einem angegebenen und konstanten Stresswert von Bedeutung. Wir haben schon gesehen, dass, wenn sich die Stressstufen ändern, der D-Wert folgt, aber in einem echten Biodekontaminationszyklus ist der Stresswert niemals konstant.
Sehen wir uns den angenommenen Trockengaszyklus an. Wenn die Gaskonzentration ansteigt, steigt auch der Stresswert an. Im Kondensationsvorgang ist die Situation aber noch komplizierter. (Eine Studie der physikalischen Chemie des Vorgangs zeigt schnell an, dass alle Biodekontaminationszyklen mit Wasserstoffperoxyd Kondensation verursachen).
In einem Kondensationszyklus steigt der Stresswert an, wenn die Dampfkonzentration auf den Taupunkt ansteigt. Zu diesem Zeitpunkt gibt es einen plötzlichen Anstieg im Stresswert, wenn sich der erste Kondensationstropfen bildet. Die Konzentration des Kondensats ändert sich auch mit der Zeit und unter den normal vorgefundenen Umständen nimmt es mit der Fortsetzung des Zyklus ab. Wenn jedoch die Kondensatmasse ansteigt, steigt auch der Stresswert an, bis er das Maximum für diese Konzentration des Kondensats erreicht. Deswegen ändert sich der Stresswert für einen echten Zyklus ständig.
Population
Aufgrund der angetroffenen Schwierigkeiten im Herstellungsvorgang ist das allgemein akzeptierte Kriterium für die Population eines BIs -50% +200%. Dies ist von einem technischen Standpunkt aus gesehen, weit verbreitet. Die Verifikation der Population verursacht ebenfalls Schwierigkeiten, weil die unterschiedlichen Techniken verschiedene Sporenanzahlen aus dem Substrat freigibt und die nachfolgenden Zählungsmethoden verlangen eine sehr gute Labortechnik, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
Zusammenfassung
Es ist schwierig, sich einen Validationsvorgang vorzustellen, der sich auf einen Indikator mit dieser Variabilität verlässt. Im zur Verfügung stehenden Platz habe ich einige, aber nicht alle der Probleme besprochen, die die Leistungsvariation eines BI verursacht. Es wird detailliertere Information zur Verfügung stehen, sobald der PDA-Stab seinen Bericht veröffentlicht.
Es gibt keine Zweifel, dass aufgrund des Versagens eines Validationszyklus viel Zeit verbracht und Anstrengungen unternommen wurden. Dies geschah nicht, weil der Zyklus fehlerhaft war sondern aufgrund der Variationen im BI.
Um die Probleme bei der Neuvalidierung zu minimalisieren, ist es notwendig, dass die Chargen der BIs den strengsten Qualitätskontrollprüfungen unterzogen werden. Diese sollte eine Zählung der Sporenpopulation und eine Messung des Widerstands des BI mit einschliessen. Die Widerstandsmessung sollte unter den Bedingungen erfolgen, die den Stressbedingungen, die der BI während der Benutzung erfährt, so ähnlich wie möglich ist.
Abschliessend muss darauf hingewiesen werden, dass, sollte der Revalidationszyklus versagen, alle Faktoren betrachtet werden, die dafür verantwortlich sind: der BI, der Zyklus, Änderungen bei den Geräten, Änderungen in der Umwelt. Obwohl ich glaube, dass der häufigst auftretende Grund des Versagens der BI ist, ist dies nicht immer der Fall.